腺癌早期诊断的探讨

胰腺癌是一高度恶性肿瘤，近几年来发病率有逐年上升的趋势。在美国，胰腺癌已列为第二大消化道肿瘤的死因(1);在中国上海，发病率在20年内增加了4倍。由于胰腺癌在临床上缺乏特异表现，恶性程度高，极易出现转移，在就诊时3/4的病人已属晚期。确诊病例手术可切除率仅为4%-27%，5年生存率<5%。如能在早期彻底根治肿瘤，5年生存率可>20%。因此发展新的筛选和诊断手段，综合分析胰腺癌高危人群，提高胰腺癌的早期诊断率，是改善胰腺癌预后的关键。

资料和方法

一. 研究对象

1994年-2000年5月的门诊及住院病人共292例，男性186例，女性106例，年龄9岁-89岁，平均55.54岁。其中胰腺癌134例，胰腺良性疾病82例(包括胰腺腺瘤6例，慢性胰腺炎51例，胰腺内分泌肿瘤25例)，胃/结肠癌38例，壶腹癌31例，胆管癌7例。正常对照组65例。胰腺癌患者中88例(65.6%)有病理诊断，8例在开腹手术中证实(未切除，无病理)，38例为临床诊断(有以下2项或2项以上影像学支持，且至少包括③④⑤⑦中的一项)。

①B超提示胰腺有低密度区，胰管扩张以及胆总管和胆囊肿大;

②CT提示胰腺局部肿大和占位性病变;

③ERCP提示胰管或胆管截然中断，断端变钝，管壁僵硬不规则或有双管征;

④选择性腹腔动脉血管造影有胰腺内肿瘤或胰外血管受侵;

⑤PTC示胆总管偏心狭窄或阻塞;

⑥超声内镜示胰腺区低密度占位性病变;

⑦MRCP示胰管或胆总管狭窄、扩张或有占位性病变。

慢性胰腺炎患者中26例有病理诊断，3例为手术证实，22例为临床诊断均符合以下标准：

(1)至少有如下2项以上的影像学支持：

①B超或/和CT提示胰腺有钙化、胰管结石、胰腺假性囊肿;

②ERCP提示胰管扭曲、狭窄、扩张;

③MRCP示有胰管或胆总管的狭窄、扩张、变形;

④超声内镜提示有胰管扩张、狭窄。

(2)有以上1项影像学的依据+1项胰腺外分泌功能检查的异常(其中包括：①secretin试验阳性;②粪便脂肪定量阳性;③BT-PABA试验重复2次明显不正常)。

(3)有1项的影像学的依据+典型的胰腺炎临床表现如：反复急性胰腺炎病史、反复的脂肪泻、糖尿病史、长期饮酒史和反复的进餐后上腹痛史。

胰腺腺瘤、胰腺内分泌肿瘤均有病理证实。正常对照组选自本院职工和外单位查体人员未发现异常者。

二. 研究方法

1.影像诊断包括B超、CT、ERCP、MRCP、超声内镜、DSA。

2. 实验诊断

(1)采用PCR-RFLP方法检测胰腺癌、胰腺良性疾病患者手术标本、胰液、血浆和粪便中K-ras第12密码子突变(2)(14);

(2)采用PCR-SSCP方法检测胰腺癌、胰腺良性疾病患者手术标本、胰液和粪便中P53第5、6、7、8外显子突变;

(3)采用P16 INK4、P21 WAF1、P53KIP1单克隆抗体和免疫组织化学Envision System 检测了胰腺癌组织中P16、P21、P27抑癌蛋白和P53突变蛋白的表达(3);

(4)采用NEOY2特异性抗体和免疫组化方法检测胰腺癌、慢性胰腺炎手术标本的NEOY2蛋白表达，利用NEOY2的cDNA探针和RNA印迹杂交分析以及免疫细胞化学法检测NEOY2基因mRNA和NEOY2蛋白在胰腺癌细胞株的表达;

(5)采用免疫细胞化学Envision System检测胰液细胞抑癌蛋白表达，协助胰液细胞形态学鉴别胰腺疾病的良恶性;

(6)采用ELISA法系统测定血清CEA、CA50、CA19-9和CA242在胰腺疾病中阳性率。

结果

一. 影像诊断

1. 腹部B超在胰腺癌(有病理证实)和胰腺良性疾病(包括胰腺腺瘤、胰腺内分泌瘤、慢性胰腺炎)的阳性率分别为76.1%(67/88)和38.8%(19 /49)，两者有统计学差异(P<0.05)，诊断敏感性为76.1%，特异性为61.2%;准确性为70.8%。

2.胰腺CT或MRI在胰腺癌(有病理证实)和胰腺良性疾病的阳性率分别为65.4%(51/78)和44.7%(21/47)。两者有统计学差异(P<0.05)，诊断敏感性为65.4%，特异性为55.3%，准确性为61.6%。

3.ERCP在胰腺癌(有病理证实)和胰腺良性疾病的阳性率分别为91.5%(54/59)和31.0%(13/42)，两者有统计学差异(P<0.05)，诊断敏感性为91.5%，特异性为69.0%，准确性为82.2%。

4.MRCP在胰腺癌(有病理证实)的阳性率为90.0%(9/10)，诊断敏感性为90.0%。

5.EUS在胰腺癌(有病理证实)和胰腺良性疾病的阳性率分别为92.0%(23/25)和54.5%(6/11)，两者有统计学差异(P<0.05)，诊断敏感性为92.0%，特异性为45.5%，准确性为77.8%。

6.DSA在胰腺癌(有病理证实)和胰腺良性疾病的阳性率分别为82.9%(34/41)和70.0%(7/10)，两者没有统计学差异(P>0.05)，诊断敏感性为82.9%，特异性为30.0%，准确性为72.5%。

二. 实验诊断

1.采用PCR-RFLP方法在病人的手术标本、胰液、血浆和粪便中检测K-ras第12密码子突变

(1)胰腺癌手术标本K-ras第12密码子突变率为87.5%(28/32); 胰腺良性疾病(包括胰腺腺瘤、胰腺内分泌瘤、慢性胰腺炎)为33.3%(8/24), 两组有统计学差异(P<0.05)。

(2)胰腺癌患者胰液K-ras突变率为86.8%(46/53);胰腺良性疾病为17.2%(5/29)，两组有统计学差异(P<0.05)。用于诊断胰腺癌的敏感性为86.8%, 特异性为82.8%, 准确性为85.4%。

(3)胰腺癌患者血浆K-ras突变率为55.0%(11/20), 胰腺良性疾病为14.2%(1/7), 两组无统计学差异(P>0.05)，与例数较少有关。

(4)粪便K-ras PCR扩增成功率为87.9%(233/265)。胰腺癌患者粪便K-ras突变率为88.9%(64/72);胰腺良性疾病为56.0%(28 /50)，(P<0.05);正常人粪便突变率为19.6%(9/46)。粪便K-ras突变检测用于诊断胰腺癌的敏感性为88.9%，特异性为 44.0%，准确性为70.5%。壶腹癌和胆管癌及胃肠癌患者的突变率分别为66.7%(14/21)和76.6%(13/17)。胃结肠良性疾病突变率 20.7%(6/29)。

同一病人不同标本K-ras突变检测结果一致性：

1)17例同时检测手术标本和胰液K-ras突变：两者检测结果一致率94.1%(16/17)

2)24例同时检测手术标本和粪便K-ras突变：两者检测结果一致率87.5%(21/24)

3)40例同时检测胰液和粪便的K-ras突变：两者检测结果一致率87.3%(35/40)

4)总共18例同时有手术标本、胰液和粪便的K-ras结果，三者一致的15例，一致率83.3%

(5)胰腺癌患者手术标本、胰液和粪便K-ras突变与否与性别(男/女)、年龄(≥60岁/<60岁)、肿瘤部位(胰头/胰体尾)、肿瘤大小(≥5cm /<5cm)、病理类型(导管腺癌/囊腺癌)、淋巴结转移与否、临床分期(Ⅰ-Ⅱ/Ⅲ-Ⅳ)、是否/能否切除无关。有29例随访时间超过9个月，K-ras突变与否与生存时间(≥9个月/<9个月)无关。

2.采用PCR-SSCP方法在病人的手术标本、胰液和粪便中检测P53第5、6、7、8外显子突变

(1) 胰腺癌手术标本P53突变率(第5、6、7、8外显子之一突变即认为P53突变)为35.7%(5/14);胰腺良性疾病(包括胰腺腺瘤、胰腺内分泌瘤、慢性胰腺炎)为0/5。

(2) 胰腺癌患者胰液细胞P53突变率为47.4%(18/38)，胰腺良性疾病为12.5%(2/16)，两组有统计学差异P<0.05。其敏感性为47.4%，特异性为87.5%, 准确性为59.3%。

(3)粪便P53PCR扩增成功率为78.6%(412/524)。胰腺癌患者粪便P53突变率为37.1%(23/62);慢性胰腺炎为19.1%(4 /21)。两组无统计学差异，P>0.05;正常人粪便P53突变率为5.5%(3/55)。粪便P53突变检测用于诊断胰腺癌的敏感性为 37.1%, 特异性为80.9%，准确性为48.2%。结肠癌和胃癌46.2%(6/13)，良性胃肠道疾病为5.6%(1/18)。

同一病人不同标本P53突变检测结果一致性

1)11例胰腺癌同时检测手术标本和粪便P53突变：两者检测结果一致率63.6%(7/11)

2)27例胰腺癌同时检测胰液和粪便P53突变：两者检测结果一致率70.4%(19/27)

3.采用P16INK4、P21WAF1、P53、P27KIP1单克隆抗体和免疫组织化学Envision System检测了胰腺癌组织中P16、P21、P27抑癌蛋白和P53突变蛋白的表达

(1)胰腺癌组织中P16、P21、P27表达缺失率和P53突变表达率分别为55.3%(21/38)、36.8%(14/38)、65.8%(25/28)和60.5%(23/38)，均高于慢性胰腺炎组织中的14.3%(2/14)、0.0%(0/14)、35.7%(5/14)和0.0%(0/14)。除P27外，两组有统计学差异，P<0.05。

(2)38例胰腺癌组织中，仅有一种抑癌蛋白表达异常的有7例(18.4%)，且仅见于P53突变表达。81.6%(31/38)的胰腺癌组织有两种以上抑癌蛋白表达异常

4.采用NEOY2特异性抗体和免疫组化方法检测了手术标本的NEOY2蛋白表达

(1)RNA印迹杂交分析以及免疫细胞化学法检测结果显示8个胰腺癌细胞株均未检测到NEOY2 mRNA和蛋白表达

(2)正常胰腺的导管、腺泡、胰岛细胞胞浆中均可见到NEOY2蛋白表达，表达缺失率为8.3%(1/12);胰腺癌表达缺失率为47.8%(11/23)

5.采用免疫细胞化学Envision System检测胰液细胞抑癌蛋白表达协助胰液细胞形态学鉴别胰腺疾病的良恶性

(1) 采用纯胰液性胰液细胞涂片、通过巴氏染色找瘤细胞，胰腺癌患者阳性率为60.0%(6/10)，胰腺良性疾病为0.0%(0/10)，P<0.05%。

(2) 胰腺癌胰液细胞P53表达率6/9高于胰腺良性疾病0/10，P16表达率1/7低于胰腺良性疾病6/10，这种差异可帮助鉴别细胞良、恶性。胰腺癌患者中有2例可疑细胞P53表达而P16表达缺失，被判断为瘤细胞。

(3) 胰液细胞学辅以检测抑癌蛋白表达在胰腺疾病良、恶性的鉴别诊断中敏感性为80.0%, 特异性为100%，准确性为90.0%。

6.采用ELISA法系统测定血清CEA、CA50、CA19-9和CA242在胰腺疾病中的阳性率：胰腺癌分别为36.4%、74.6%、81.9%和69.7%;胰腺良性疾病分别为5.3%、17.8%、26.7%和28.6%。

各指标用于胰腺癌诊断的敏感性、特异性和准确性分别为：CEA>5u/ml：36.4%、94.7%和54.0%;CA50>20u/ml： 74.6%、82.2%和76.7%;CA19-9>37u/ml：81.9%、73.3%和79.5%;CA242>17u /ml：69.7%、71.4%和70.1%。

讨论

一. 胰腺癌影像诊断方法评价胰腺癌早期缺乏特异性的临床表现。目前一些影像检查方法虽能帮助确诊，但对胰腺癌的早期检出有时仍很困难。

B 超简便易行，无痛无创伤，能直接显示胰腺及胰周围图像，可反复检查，一般推为首选，但容易受到肠道气体及体胖干扰，可出现假阴性或假阳性。无黄疸期胰头壶腹癌，多有胆囊肿大或/和胆管扩张，B超发现胆管扩张需进一步检查，可能检出早期肿瘤。胰腺癌诊断的阳性率为76.1%，胰腺良性疾病为38.8%。

CT能比较清楚了解病变累及范围，有益于决定治疗方案，且无痛，无创伤性，但亦有假阳性或与慢性胰腺炎鉴别困难情况。本研究CT诊断胰腺癌阳性率65.4%，低于文献报告90%-97%(4)。胰腺良性疾病诊断率为44.7%。

ERCP 的优点是能观察胰头病变有无浸润十二指肠乳头区以及胰管和胆管形态的变化。其确诊率远较B超和CT为高。其主要缺点与局灶性慢性胰腺炎难以鉴别。应强调综合诊断重要性。本研究ERCP在胰腺癌影像学诊断中具有最高的诊断敏感性和准确性。胰腺癌诊断阳性率为91.5%，胰腺良性疾病为31%。

MRCP是近年来发展的新技术，由于MR对充满液体结构的脏器显示是敏感的，故不需用造影剂。本研究阳性率为90%。由于病例数少，目前难以定论。

EUS 诊断胰腺疾病已广泛应用于临床。近年来由于技术上改进能检出小胰癌，优于CT、B超。本研究对胰腺癌诊断正确率达92%，与文献报告90%-95%相一致(5)。胰腺良性疾病的诊断率为54.5%。EUS能清楚显示肿块部位、主胰管及其扩张程度，并可在超声内镜下进行穿刺明确诊断，尤其是在与局灶性胰腺炎难以鉴别时。

联合影像学检查可提高诊断率，单独采用B超、CT胰腺癌诊断率较低，但如与ERCP联合可提高诊断敏感性达90%-95%以上。

二. 胰液中K-ras、P53检测在诊断胰腺癌中的意义

由于胰腺癌诊断上的困难，近些年在国际上已尝试利用各种标本K-ras突变的检测来摸索胰腺癌诊断的新手段。其中包括胰腺细针穿刺组织、胰液、十二指肠液、粪便等。利用胰液来检测K-ras的突变是研究的热点之一，如能在患者行ERCP术时，同时获取胰液检测K-ras基因突变，可能对胰腺癌的诊断有所帮助。我们的结果表明在胰腺癌患者的胰液K-ras突变敏感性87.8%，特异性76.4%，准确性84.5%，与文献报道基本上是一致，见表。

因此，应用胰液中K-ras基因突变的检测是可以成为胰腺癌诊断的辅助手段。

利用胰液中的P53突变来诊断胰腺导管癌，敏感性为47.4%(18/32)，特异性为87.5%(12/14)，与Kondoh报道一致(9)。胰腺良性疾病阳性检出率为14.2%(2/14)，两组有统计学差异(P<0.01)，对术前胰腺良、恶性疾病的判断具有一定的帮助。

三.粪便中检测K-ras、P53突变在胰腺癌筛选中的意义

1.据为数不多的文献报道，粪便K-ras突变率在结肠癌为25%-80%，胰腺癌为42%-55%，但检测例数都很少(11-40例)，扩增成功率不满意(44%-70%)(10)(11)(12)(13)。本研究结果显示胰腺癌患者的粪便K-ras扩增成功率为87.9%(233/265)，明显高于文献报道，这与DNA提取方法改良有关(14)。胰腺癌患者粪便K-ras突变率达88.9%(64/72), 高于胰腺良性疾病56%、壶腹癌66.7%、胃肠癌76.6%(接近文献报道)和正常对照19.6%。除胃肠癌外，各组与胰腺癌组相比均有统计学差异(P<0.05)。在胰腺良恶性疾病鉴别上，粪便K-ras突变检测的敏感性为88.9%，特异性为44.0%，准确性为70.5%。在正常人中阳性率低，可以用于筛选。在同时检测多项标本的胰腺癌患者中，手术标本、胰液、粪便K-ras突变结果一致率为83.3%, 说明粪便K-ras突变可能很好地反映前两者，具有较高的阴性预测值。

2.胰腺癌患者粪便P53的突变率为37.1%, 慢性胰腺炎为19.1%(4/21)，结肠癌和胃癌为46.2%(6/13)。良性胃肠道疾病为5.6%(1/17),正常人5.5%(3/55)。胰腺癌与正常人和良性上胃肠道疾病间有极显著差异(P<0.01)。胰腺癌与慢性胰腺炎组间有差别，但在统计学上无显著差异，其原因可能和后者病例数少有关。

胰腺癌组有手术标本者进行P53检测与粪便P53突变一致率为63.6%，同样胰液与粪便P53的一致率为70.4%。 Eguchi(15)对25例结肠癌病人的粪便进行P53检测，其结果与组织一致性为80%(20/25)。目前国内外尚无对胰腺癌病人粪便进行P53检测。

此外，粪便P53检测胰腺癌和正常人中有较高的特异性，可达到94.5%，但由于敏感性不高，其应用有一定的局限性，若结合敏感性高的粪便K-ras可以提高敏感性达96.9%(30/31),准确性为81.0%, 进一步增强其在筛选中的价值。

在其他恶性肿瘤如壶腹癌、胆管癌、胃、结肠癌的粪便中有时也可检测到K-ras、P53突变，需要鉴别诊断。这些肿瘤出现症状有特征性，如黑便、肠梗阻、黄疸等消化道症状有利于临床医生锁定诊断思路，可以通过造影、内镜等方便、直观的手段排除胃肠道肿瘤，间接对胰腺癌早期发现有重要意义。

四.联合试验的意义

1.胰液细胞抑癌蛋白的表达改变可以协助胰液细胞形态学鉴别胰腺疾病的良恶性。

十二指肠液细胞学首次报道于1949年。但在十二指肠液的酶解作用下，细胞迅速被降解，干扰结果的分析，在胰液中增生细胞的形态可以较好地保持。实验证明，静脉注射促胰液素后第一个5分钟的胰液细胞退化严重，而第三个5分钟的胰液增生细胞退化程度最轻，细胞形态保持最好，且不含造影剂。我们利用第3个5分钟内的胰液，其结果10例细胞收集成功的胰腺癌中，6例找到瘤细胞，而非癌组未找到瘤细胞，敏感性为60%，特异性100%，准确性80%。

与胰腺癌组织不同，胰液细胞P21和P27抑癌蛋白表达缺失率没有明显增加，对鉴别诊断帮助不大，但是恶性病的P53表达率明显高于良性病，P16的表达也明显低于非癌组，可帮助鉴别良、恶性。在非胰腺癌的组织细胞及胰液细胞中P53的突变表达率为0%，P16的表达缺失率极低，表明以此作为诊断标准的假阳性率很低。根据此标准，本研究的癌组病人中还有2例找到可疑细胞，因P53强阳性且P16阴性，被判为有瘤细胞特征。结合免疫细胞化学检测结果，总阳性率 8/10(80%)，准确性为90.0%。有1例胰腺囊腺癌病人胰液中找到癌细胞抑癌蛋白表达与其肿瘤组织完全一致。进一步证实胰液细胞学的科学性。

2.粪便K-ras与P53突变检测联合。如1项阳性即为阳性，敏感性可达96.9%，准确性为81.0%，进一步增强其在筛选中的价值。如两项均阳性才为阳性，特异性可达100%，准确性为63.8%，可以进一步帮助判断患瘤可能。在有手术病理证实的T1期6例患者中，胰液K-ras、粪便K-ras和胰液 P53、粪便P53的突变率与T2期以上的患者类似。

3.肿瘤标记物对胰腺癌诊断有帮助。CA19-9具有较高的敏感性81.9%。通过联合CA50、CA19-9和CA242中任何二项的敏感性均可达82%以上，特异性可达88%以上。但这组胰腺癌患者大多属于中晚期。有报道在高危人群或早期癌中CA系列阳性率明显低于此。以CA19-9为例早期癌敏感性仅为42.9%-58.1%(16)(17)。

结论

1.在胰腺癌影像学诊断中，ERCP具有最高的诊断敏感性和准确性。

2.超声内镜的准确性可与ERCP媲美，还可进行术前TNM分期。

3.单独采用B超、CT诊断胰腺癌诊断率较低，但如与ERCP联合可提高诊断敏感性达90%-95%以上。

4.CA19-9具有较高的敏感性81.9%，通过联合CA50、CA19-9和CA242中任何两项的敏感性均可达82%以上，特异性可达88%以上。

5.胰腺癌患者的胰液K-ras突变率86.8%，P53 47.4%。改良的胰液细胞学检查的敏感性80.0%。任何一项与ERCP联合平行试验，敏感性可达90%-95%以上。K-ras或细胞学与ERCP联合系列试验在保持敏感性80%的同时特异性达90%以上。

6.改良粪便DNA提取方法，可获得满意的PCR扩增成功率，其中K-ras扩增成功率为87.9%。P53扩增成功率为78.6%，均明显高于国外文献报道的44.7%。

7.文献报道胰腺癌患者粪便K-ras检测结果：1694年Caldas C用斑点杂交所得阳性率为54.5%;1698年Berndt C用突变富集PCR方法所得阳性率为42.3%;2000年本院用RFLP方法所得阳性率为88.0%。

8.粪便K-ras突变检测具有高扩增率，高敏感性(88.9%)。对手术标本和胰液K-ras突变的阴性预测值高，重复性好等优点，对胰腺癌有重要的筛选价值。

9.粪便P53在胰腺癌中突变率为37.1%，但在正常人群中阳性率极低5.5%。可以协助K-ras突变检测进行筛选。

10. 提高胰腺癌的早期诊断率——联合试验是关键。联合粪便K-ras突变和P53突变检测，平行试验的敏感性可达93.2%。通过上述两项之一与CA19-9的联合系列试验，特异性可达85%-100%。

在有手术和病理证实的T1期6例患者中，胰液K-ras、粪便K-ras和胰液P53、粪便P53的突变率与T2期以上患者类似。

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